诺丽对淋巴癌作用原理美国

发酵诺丽渗出液处理的树突状细胞对B淋巴细胞的增殖和分化的直接影响

医院系统大学肿瘤研究所医疗中心

夏威夷大学马诺陋阿分校约翰·伯恩斯医学院补充和替代医学部

美国克莱姆森大学生物科学系

摘要：诺丽果汁作为民间药物使用已有两千多年的历史。近期，科研人员成功地从诺丽果汁中提取到一些活性物质并进行了深入研究。树突状细胞（DCS）是非特异性及特异性免疫应答和维持自身免疫耐受性的核心调节因子。在本研究中，使用发酵有诺丽渗出液处理DCS，探究经fNE处理的DCS（fNE处理有树突状细胞）对免疫的调节功能。研究发现，fNE处理的树突状细胞能够特别刺激脾细胞增殖，其中，B细胞是主要的反应细胞群。B细胞对fNE处理树突状细胞产生的增殖反应依赖于细胞接触，不依赖于CD40L；而DCS的粘附特性促使大量的DC－B细胞结合成簇形成。此外，结果表明fNE处理的树突状细胞促进了B细胞分化以及免疫球蛋白的转化。本研究结果为今后fNE作为免疫系统的生物反应调节剂的进一步探索奠定了基础。

1引言

海巴戟（茜草科），又被称为“诺丽”，是一种小乔木，广泛生长于波利尼西亚。其根、树皮、茎、叶和果实均被当作民问药物用于治疗许多疾病。据早期科学研究，诺丽具有广泛的医疗作用，包括抗细菌，抗病毒，抗真菌，抗肿瘤，驱虫，镇痛，降血压，抗炎和增强免疫等。此外，诺丽果汁已通过欧盟的一项安全性评价，并发现可供人食用。目前，已有很多针对诺丽果汁活性物质的提取及其作用机制的研究。其中有研究发现，每天给植入Lewis肺癌细胞的小鼠腹腔内注射诺丽果汁，能够显着增加小鼠的寿命。这种抗肿瘤活性与诺丽果汁中丰富的多糖类物质(Noni-ppt)有关。进一步的研究表明，Noni-ppt麓够刺激细胞因子的释放，如小鼠效应细胞TNF-α、IL-Ib、IL-12、IFN-γ和IL-10等细胞因子的释放，但抑制IL-4的释放，同时对IL-2的产生无任何影响。因此，Noni-ppt的抗肿瘤疗效是表现在抑制Th2体液免疫反应的同时刺激Thl细胞介导免疫反应。研究还表明，诺丽根部的一种成分：虎刺素(Dam)，能够抑制病毒蛋白R(Vpr)，诱导病毒死亡，具有潜在的抗病毒疗效。

树突状细胞(DCs)是非特异性及特异性免疫应答和维持自身免疫耐受性的核心调节因子。同时，DCs加载某些抗原是治疗不同疾病，包括癌症、传染病、自身免疫性疾病的潜在有效因子。例如，DC。加上从海绵体中分离的一种鞘糖脂——α-半乳糖酰基鞘氨醇，能够有效地激活自然杀伤T细胞(NKT)，并表现出有效的抗肿瘤和抗感染活性。我们实验室的研究还表明：发酵的诺丽渗出液fNE，即一种经过特殊预处理的诺丽果汁）在活小鼠体内的输送，不仅能够有效地抵抗肿瘤，而且能够消除现有的肿瘤。本文针对经fNE赴理的DCs(fNE-treatedDCs)是否能够直接调控免疫细胞进行了深入研究。

2材料和方法

2.1　fNE

收集来自夏威夷南部科哈拉海岸卡韦哈伊的成熟诺丽果，除去茎，用经过稀释的餐具洗涤剂和软刷将果实洗净，之后用去离子水彻底漂洗。将果子放置在洁净、干燥的不锈钢滤网上排掉多余水分，后置于温度24-30℃、湿度在45-55%的容器中发酵。发酵14天后，将果子的渗出液收集于塑料瓶中，置-20℃冷冻保存。在使用前，将fNE解冻至室温，并用10NNaOH调节pH至7.4，然后rpm离心10分钟，收集上清液用0.22微米的膜(CorningIncorporated，NY)过滤除菌，后使用Detoxi-Gel内毒素清除柱清除fNE中的内毒素即可。

2.2小鼠和各种细胞

将杰克逊实验室取来的六到八周的雌性C57BL/6J小鼠放置在无病原体的动物设施内，按照之前研究中所用的方法培养DCs。简单过程为：将小鼠的股骨和肱骨中的骨髓冲洗下来，然后用40微米的尼龙细胞过滤器将其过滤。用ACK裂解缓冲液丢除红细胞后，将剩余细胞悬浮在DC培养基中，使悬浮液浓度为2×个细胞/mL。DC培养基配方为：RPMI-(Cell-groMediatechInc,Herndon,VA),10%FBS(Hy-Clone,ThermoFisherScientificInc,UT),50μg/mL庆大霉素(GibcoBRL)和20ng/mLrmCM-CSF(Sigma，St．Louis，MO)。之后，将细胞悬浮液分装到直径为l00mm的无涂层培养皿中，每个培养皿分装l0mL。在第3天，向每个培养皿中加入l0mL新鲜的DC培养基。之后，向培养液中加入l00ng/mL的LPS(Sigma)并培养24小时后即成为成熟的DCs（LPS-成熟DCs）。添加不同的浓度的fNE至DC培养液中，增殖分析试验前培养1至4天，这样即得到经fNE处理的DCs（fNE-treatedDCs）。

从小鼠脾脏中获得的脾细胞，使用Dynal负分离试剂盒分离纯化可得到B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞，使用MACSNK细胞分离试剂盒分离纯化可得到NK细胞。经FACS分析测定，这些细胞的纯度可达90%以上。

2.3增殖分析测定试验

将2×或4×个DCs与2×个脾细胞、或2×个B细胞、或2x个CD4+T细胞、或2x个CD8+T细胞、或2xl05个NK细胞混合培养在终体积为μl的RPMI-培养液中（使用圆底的96孔板中），培养3至8天。培养结束前的16小时，向每个小孔中加入1μCi[甲基-3H]一胸腺嘧啶(GEHealthcare，Piscataway，NJ)。细胞增殖测定是使用[3H]-胸腺嘧啶提取试验试剂盒，使用MicroBetaTRILUX液体闪烁和发光计数器测定数量。

使用BDFalcon96多孔插入系统测定侵袭小室。将2×B细胞中加入到插件中，同时加入4×个DCs（共培养）或加入空白孔单独培养。第3天，在每个插件或小孔中各加入1μCi[甲基-3H]一胸腺嘧啶，16小时后，即可进行细胞增殖分析测定。

2.4免疫球蚤白定量检测

将一百万个脾细胞或B细胞与等量的经过不同浓度fNE处理的DCs，加入到终体积为1mL的RPMI-培养基中（使用24孔板），培养两个星期后，用小鼠IgM/lgG抗体定量ELISA试剂盒对培养液上清液中的IgM和IgC进行浓度测定。

2.5统计分析

每个实验至少重复三次，三组数据经过计算表示为平均值±S．E．M．。用GraphPadPrism4软件对组间不同水平的有效数据进行分析，P值0.05被认为具有统计学意义。

3结果

3.1fNE处理的树突状细胞诱导同源脾细胞和B细胞的增殖

川野等人的报告表明：α-GalCer加载DCs后能够选择性刺激同系的有效的NKT细胞的增殖。为探索fNE是否有相似的生物活性，分别使用浓度为10%、4%、2%、1%和0.1%的fNE对LPS-成熟DCs进行处理。处理后洗涤3次，将fNE处理的树突状细胞与脾细胞以1：5和1：10的比例共培养3天。与普通的DCs相比，fNE处理的树突状细胞有更多诱导脾细胞增殖的潜能，最佳的fNE浓度为10%和4%(P0.)。脾细胞与DCs的比例为5：1，fNE低至1%时，仍能够刺激脾细胞增殖（P0.05，图1A）。下面的实验中均使用浓度为4%的fNE。

图1fNE处理的树突状细胞刺激脾细胞和B细胞增殖。(A)分别使用浓度确定的嘧啶、α-GalCer和fNE将LPS-成熟DCs处理一天后，将DCs与脾细胞以1：5和1：10的比例共培养。(B)分别用含内毒素和不含内毒素的fNE，分别处理LPS-成熟DCs和未成熟DCs一天，之后将其与脾细胞以1：5的比例共同培养。(C)使用4%fNE处理LPS-成熟DCs-天，后将其分别与脾细胞、B细胞、CD4+T细胞、C.D8+T细胞和NK细胞，以1：5的比例共同培养：(D)经flNE处理一天的LPS-成熟DCs和未成熟DCs分别与B细胞共同培养。经过3天的共同培养，使用[3H]．胸腺嘧啶提取试验试剂盒对细胞增殖情况进行测定=总结3个独立重复试验，得到图表中的数据（*P0.05，**P0.01，***P0.）。

在本研究中，由于使用的fNE含有内毒素（0.25微克／毫升，未发表的数据），故我们也做了相关实验，以确定脾细胞的增殖是否与fNE中的内毒素有关。用浓度为8%的无内毒素的fNE分别处理未成熟的DCs或LPS-成熟DCs（无内毒素fNE在纯化过程中会被稀释），而后分别刺激脾细胞。发现经过含内毒素的fNE处理的LPS-成熟DCs和未成熟DCs均可刺激脾细胞增殖，无内毒素的fNE只能激发LPS-成熟DCs刺激脾细胞增殖（图1B）

为了确定在脾细胞中的哪种绌胞是fNE处理的树突状细胞的主要应答细胞，将B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞和NK细胞均从脾细胞中分离出来，然后将这几种细胞与fNE处理的树突状细胞以5：1的比例，共同培养3天。实验表明，B细胞是fNE处理的树突状细胞的主要应答细胞(P0.01)，而CD4+T细胞反应轻微(JP0.05)，CD8+T细脆和NK细胞几乎没有反应（图1C）。fNE处理后的LPS-成熟DCs和未成熟DCs均能够刺激B细胞增殖（图ID）。

图2fNE处理时间和DC/B共同培养时间优化。(A)经4%fNE处理1-3大的LPS-成熟DCs，与B细胞以1：5的比例共培养3天。(B)经4%fNE处理3天的LPS-成熟DCs，与B细胞以1:5的比例共培养至8天。培养结束，使用[3H]．胸腺嘧啶提取试验试剂盒对细胞增殖情况进行测定。总结3个独立重复试验，得到图表中的数据(*P0.05，**P0.0l，***P0.)。

为了优化fNE处理的时间，DCs用4%fNE处理3天，并用于刺激B细胞。增殖结果显示，尽管DCs用fNE处理l天可以有效的刺激B细胞的增殖(P0.05)，但处理2天或3天时增殖效果最好（P0.，图2A）。我们对fNE处理的DC和B细胞的共同培养时间也进行了优化，如图2B中所示，共培养4天产生最高的B细胞刺激(P0.)，共培养3天也能极大地刺激B细胞增殖(P0.01)。这些数据清楚地表明，适宜的fNE处理的树突状细胞可直接刺激纯化的B细胞增殖。

3.2B细胞对fNE处理的树突状细胞产生的增殖反应依赖于细胞接触，不依赖于CD40L

为了证实fNF处理的树突状细胞刺激B细胞增生与T细胞残留的CD40L无关，饱和的抗CD40L单克隆抗体被应用于fNE处理的树突状细胞和B细胞的共同培养体系中，以中和CD40L。结果表明，fNE处理的树突状细胞刺激B细胞增殖在3组实验中是相同的：没有同系抗体，有同系抗体和有抗CD40L抗体（图3A）。为了排除fNE直接刺激B细胞增殖的可能性，不同浓度的fNE被加入到B细胞培养液中4天，其中一个加入LPS-成熟DCs(ng/mL)作为阳性对照。结果(图3B)表明烈E不能单独刺激B细胞增殖。

fNE处理的树突状细胞刺激B细胞增殖的途径有两种可能：fNE刺激DCs的功能改变，使之成为B细胞增殖的催化剂，或附着在DCs表面的来自fNE的残留抗原可能刺激了B细胞增殖。MacPher-son等曾报道用EDTA清洗DCs表面以除去残留的有效抗原，因此，在将fNE处理的树突状细胞与B细胞混合前，使用含25mMEDTA的PBS对fNE处理的树突状细胞进行充分洗涤。令人惊讶的是，EDTA没有消除DCs的刺激作用，还增强B细胞的增殖（图3C）。随后，我们用Transwell培养系统，来确定fNE处理的树突状细胞的刺激增殖作用是否需要细胞接触。在这个系统中，利用0.1微米孔隙的聚对苯二甲酸乙二醇酯膜将fNE处理的树突状细胞与B细胞分离开。如图3D所示，fNF处理的树突状细胞对B细胞增殖的促进作用，需要细胞问的接触。综上所述，fNE处理的树突状细胞对B细胞增殖的促进作用，需要细胞间的接触，不依赖于CD40L，对EDTA有适应牲；单独的fNE不能诱导的B细胞增殖。

3.3fNE不会改变DCs表面关键物质的表达

接下来的实验中，我们要对fNE是否会改变DCs表面关键物质的表达进行研究。将经fNE处理的DCs和不经fNE处理的DCs，用荧光素FITC标记的大鼠抗小鼠CD40、CD80、CD83、CD86、小鼠抗小鼠I-Ab和大鼠抗小鼠CD分别着色。经fNE处理的DCs和不经fNE处理的DCs在表面分子表达方面，没有明显区别。

3.4fNE处理的树突状细胞促进B细胞的分化

当fNE处理的树突状细胞与B细胞共同培养时，大量DC-B细胞结合簇的形成是B细胞分化的主要现象。没有经fNE处理的DCs与B细胞共同培养时，没有出现这一现象（图4A和B）。经过2周的共培养，与未经fNE处理的DCs与B细胞共同培养液相比fNE

图3B细胞对fNE处理的树突状细胞产生的增殖反应依赖于细胞接触，不依赖于CD40L。(A)使用4%fNE对3组LPS-成熟DCs处理3天。其巾两组DCs在与B细胞混合前30min，分别加入了I司源抗体（0.5μg/mL）和抗鼠CD40L抗体（0.5μg／mL）。(B)单独的不同浓度的fNE刺激B细胞增殖的效果。(C)使用4%fNE对LPS-咸熟DCs处理3天DCs，将fNE处理的树突状细胞与B细胞混合前，使用含25mMEDTA的PBS洗涤3次。(D)使用4%fNE对LPS-成熟DCs处理3天DCs，-组与B细胞共同培养，另一组5B细胞混合后在transwell系统中分开培养。使用[3H]一胸腺嘧啶提取试验试剂盒对B细胞的情况进行测定。总结3个独立重复试验，得到图表中的数据（*PO.05，**P0.01．***P0.）。

图4fNF处理的树突状细胞直接刺激B细胞生成IgG和IgM。使用4%fNE对LPS-成熟DCs处理3天后，将处理后的DCs与脾细胞或B细胞以1：5的比例混合培养两周。A和B为混合培养3天后的显微对比照片。C和D为共同培养两周后，上清液中IgM和IgC的分析结果．图表中的数据是通过总结3个独立重复试验得到（***P0.）。

处理的树突状细胞与B细胞共培养的上清液中IgM和IgG水平显着升高(P0.，图4C和D)。

4讨论

两类抗原可诱导B细胞产生免疫应答：胸腺依赖性抗原(TD)和非胸腺依赖性抗原(TI)。TD抗原是蛋白质或多肽类物质，其诱导免疫应答需要T细胞辅助；而TI抗原通常为多糖，无需T细胞辅助。TI抗原的特征为：分子量较高、重复的抗原决定簇、在体内降解缓慢。这类抗原，如细菌多糖荚膜，可引起快速的多价BCR交联的抗体反应。有研究表明，DCs参与TI抗原刺激B细胞。DCs表达的B淋巴细胞刺激蛋白(BLys)和诱导增殖配体(APRIL)均能调节B细胞发育、存活和活化。体内脾边缘区或肠道固有层的B细胞，可以通过非胸腺依赖性的方式与BLvS和A—PRIL产生反应，进行类别转换，及时的保护机体对抗入侵的病原体。最近，进一步研究表明，存在于骨髓利基中的DCs的提供了一个重要的细胞因子：巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)，以维持骨髓利基中循环B细胞的生存，参与非胸腺依赖性体液免疫反应，对抗通过血液传播的微生物。

诺丽果作为药物使用已有两千多年的历史，其治疗作用广泛，包括抗菌和抗肿瘤。诺丽果汁的高分子量成分主要为果胶多糖，包含HG、RG、中性侧链半乳聚糖和阿拉伯聚糖。低水平的ACP存在，伴随着微量的木葡聚糖、异木聚糖和hter-omannan也存在。果胶与中药的免疫调节作用有关联，他们所起的作用可能Noni-ppt相类似。之前有研究发现，Noni-ppt能够激活巨噬细胞、T细胞、NK细胞，并刺激细胞释放细胞因子，如TNF-a，11-18，IL-12,IFN-a和IL-10。我们实验室的研究还表明：fNE（一种经过特殊预处理的诺丽果汁）在活有机体内的输送，不仅使小鼠能够有效地抵抗肿瘤，而且能够消除现右的肿瘤。

在本研究中，我们探讨fNE对DCs的生物活性的影响。使用fNE处理的未成熟的DCs或LPS成熟的DCs均能刺激小鼠脾细胞增殖，其中，B细胞是主要的反应细胞群。单独的fNE不能直接刺激B细胞增殖。fNE含有内毒素（0.25微克／毫升）这一事实可以能够解释为什么fNE处理的未成熟DC能够刺激脾细胞和B细胞增殖。不含内毒素的fNE只能作用于LPS-成熟DCs刺激B细胞增殖，这一结果表明fNE内毒素以外的成分参与了这个生物活性。B细胞对fNE处理的DCs产生的增殖反应依赖于细胞接触，不依赖于CD40L。尽管经fNE处埋后DCs表面的主要功能分子的表达，如CD80，CD83,CD86和I-Ab，没有改变，但大量的DC-B细胞结合簇形成，证明这些DCs的粘合特性被增强。本研究最重要的发现是，fNE处理的树突状细胞不仅能诱导B细胞增殖，而且还能促进其分化和免疫球蛋白的转换。对于fNE刺激B细胞的有效活性成分的识别，不仅能够提供更多的关于DC-B相互作用的信息，还为抗癌药物的发展奠定了基础。

5致谢

我们感谢EricHolle和他团队在此研究中对小鼠的专业护理，感谢LakendraWorkman在这项研究中的行政管理贡献。本研究还得到GHS肿瘤学的捐赠(Y．W．，T．E．W．)和WilliamK．和Fran-cesJ．Bryan的肿瘤研究新希望基金(Y．W．，T．E．W．)。

（选自希腊《肿瘤学报告》，21：-。）